综述 | 细胞极性在牙发育中的研究进展
引用本文：徐于婵，牛好曼，郭维华. 细胞极性在牙发育中的研究进展[J]. 中国实用口腔科杂志，2022，15（3）：364-369. DOI：10.19538/j.kq.2022.03.023.
摘要：细胞极性是指由于极性蛋白复合物之间的相互协作或排斥，使细胞骨架、细胞器以及生物大分子等呈极性分布的特性。细胞各个部分实现不同生理功能需要细胞极性蛋白及分子的精密调控。细胞极性在牙发育中发挥着重要作用，特别对于成釉细胞和成牙本质细胞的分化和功能意义重大。文章就细胞极性及相关分子和通路在牙发育中的研究进展进行综述。
关键词：细胞极性；牙发育；成釉细胞；成牙本质细胞
细胞极性，指细胞骨架、细胞器以及生物大分子的非对称分布的特性。根据细胞形态和细胞极性形成方式的不同，细胞极性可分为四大类：顶端-基底极性（apical-basal polarity，ABP）、平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）、前后轴极性（front-rear polarity，FRP）及极性分裂中的细胞极性［1］。其中，与牙发育相关的主要是ABP和PCP。牙发育过程中，成釉细胞和成牙本质细胞均发生极化，胞核远离基底膜，细胞器丰富并位于近基底膜方向，极化的形成对二者的分化成熟和功能发挥至关重要。但是，哪些分子和通路参与了成釉细胞和成牙本质细胞极性的形成和维持有待进一步研究。本文就细胞极性以及牙发育中极性相关调控分子通路的研究进展做一综述。
1 细胞极性及相关分子
细胞极性是指由于极性蛋白复合物之间的相互协作或排斥，使细胞骨架、细胞器以及生物大分子等呈极性分布，使细胞的不同区域可以发挥不同功能，在胚胎发育、细胞分化、细胞迁移、细胞不对称分裂、肿瘤发生发展等过程中起重要作用［2］。一旦极性发生变化，细胞的增殖、迁移、黏附等随之改变从而引发疾病。极性相关的蛋白质复合体包括Par、Scribble和Crumb复合体，这些蛋白质分子构成了极性形成网络，此外近来受关注的还包括Rho家族蛋白。
1. 1 ABP ABP即细胞内各种亚细胞成分和结构沿顶底轴表现出来的不对称性：靠近基底膜的一侧为顶端面，其对侧为细胞基底面。上皮细胞可沿着顶端-基底轴极化形成顶底极性，即由紧密排列的微绒毛组成腔隙侧或顶膜面［3］。细胞侧面存在侧壁结构域，介导细胞与细胞之间的黏附和连接；基底域与细胞外基质接触，这种区域化的极性分布特征使细胞相互连接成片层状，支撑组织形态形成，并起到扩散屏障的作用［4］。
ABP的建立和维持对于正常细胞的生理功能和组织稳态至关重要，需要极性蛋白复合物、细胞连接蛋白、细胞外基质等共同协调完成［5］。细胞-细胞间的接触和细胞-细胞外基质间的接触启动了极性蛋白募集，极性蛋白之间复杂的相互作用使分子沿着顶底轴不对称分布。细胞器发生重定位，细胞核位于细胞的基底端，高尔基体位于细胞核的顶端，高尔基体与细胞核的相对位置决定了细胞顶底极性及分泌轴的方向［6］。
1. 2 PCP PCP是指细胞平面的细胞极性，假设ABP为Z轴，则PCP可视作与之相交的X轴和Y轴［7］。PCP调控各种细胞行为和结构，如PCP蛋白VANGL2确定了Tomes突的分泌侧［8］。尽管已在牙胚、成釉细胞中检测到几种PCP成分的表达，但对这些PCP蛋白在牙发育过程中作用的了解仍然有待研究［8-10］。
近年来，Wnt经典/非经典通路在调控PCP中的作用引起学者们的关注。在PCP相关信号通路的传导中，Fz受体激活具有小GTPases RAC1和Ras同源基因家族，下游效应分子RhoA和c-Jun N端激酶（JNK）发生级联反应，由此控制细胞骨架和基因表达［11］。此外，还发现Wnt可以通过GSK3调控RAC信号传导，对细胞骨架及细胞凋亡产生影响，Rho、RAC等小GTPase替代β-连环蛋白接收Wnt信号，从而调节细胞骨架蛋白［12-13］。
1. 3 细胞极性蛋白复合物 Par复合体包括Par3、Par6及aPKC 3种蛋白［14］。Horikoshi等［15］总结上皮细胞发育过程中有两个基本过程：细胞连接的形成和功能性细胞膜的不同分布，Par复合体参与了其中紧密连接和顶端结构域的形成。
Scribble复合体包含Scribble、Dlg和Lgl 3种蛋白，在信号传导、细胞骨架重建以及膜泡运输等过程中发挥不可或缺的作用，其中信号传导包括了TNF/JNK/P38、Wnt、Notch等有关细胞迁移、分化等的信号通路［14］。Scribble、Dlg和Lgl 3种蛋白在结构上有特殊的蛋白结合域，在位置上处于特定的基底侧，因此决定了作为信号骨架蛋白的Scribble复合体在特定位置与特定蛋白结合传递信号的特征。在这些信号通路中，细胞迁移相关通路与肿瘤形成有着密不可分的关系，Scribble复合体缺失或基因突变与许多入侵性肿瘤相关，但该复合体调控细胞迁移的机制尚不明确，有学者认为是Scribble复合体位置的改变导致其结合的蛋白发生改变［2］。
Crumb复合体包含Crumb、PATJ和PALS1 3种跨膜蛋白，Crumb复合体和Par复合体都位于上皮细胞的顶端部分并共同参与调控细胞迁移等细胞活动［16］。研究发现上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程中这两种复合体表达量和位置都发生改变，而EMT往往是一些上皮源性肿瘤的特征，这提示Crumb、Par复合体协同调控上皮细胞迁移能力，但由于极性蛋白之间的交流错综复杂，因此复合体中各种蛋白质在其中扮演什么角色还需进一步深入研究。
细胞极性决定了细胞行使正常功能，Rho家族蛋白在维持细胞极性起到了重要作用［17］。Rho家族蛋白主要包括了RhoA、Rac1及CDC42。在细胞迁移中，Rac1和CDC42负责调控细胞前突，而RhoA负责调控细胞回缩。Elias等［18］发现，输尿管芽CDC42缺失会通过对细胞极性改变而引发肾脏衰竭。此外，Rho家族蛋白中成员通过相互的正反馈循环参与了细胞极性早期的形成。研究发现，Rho家族蛋白通过调控微管实现细胞迁移；此外，CDC42、RhoA及Rac1各自会促进丝状伪足、肌动蛋白收缩和聚合以及板状伪足形成［19］。Rho家族蛋白作为分子开关，有2种状态：与GDP结合的失活状态和与GTP结合的激活状态；在与GTP结合时，它们可与下游效应因子相互作用，引发多种细胞反应［20-21］。Rho家族蛋白参与调节多种细胞生理活动，尤其在细胞骨架重排方面发挥重要作用，通过对肌动蛋白聚合、肌球蛋白收缩和微管动力学的影响，调节细胞迁移、细胞形状和极性形成［22］。此外，Rho家族蛋白还在肿瘤的发生、侵袭和转移、神经发育、细胞周期的进展、细胞分化、基因转录和凋亡等方面发挥作用［21］。
2 成釉细胞极性及其相关的分子与通路
2. 1 成釉细胞的极性 成釉细胞是上皮来源的惟一能产生硬组织的细胞，是牙釉质形成的关键细胞。该细胞既能合成和分泌牙釉质基质，又对这些基质有重吸收和降解作用，同时也与钙盐的活跃转运有关。当釉质形成时，内釉上皮不同部位的细胞处于釉质形成的不同阶段；但在釉质发育完成后，每个成釉细胞都经历了一个相似的生命周期。成釉细胞在形成釉质过程中发生细胞骨架重排，并在形态学上发生显著改变。成釉细胞的分化过程可分为分泌前期、分泌期、转化期、成熟期和成熟后期［23-24］。这些细胞在外部形态、内部结构、与周围组织的关系特征、细胞的分泌和再吸收特征等方面均有不同［25］。
分泌前期，内釉上皮开始分化为前成釉细胞，内釉上皮细胞呈柱状或立方状，胞核大而居中，高尔基复合体分布于细胞的远端，细胞借助半桥粒与基板结合。前成釉细胞呈矮柱状，胞核大而居中，胞质内有散在的线粒体、高尔基复合体，粗面内质网未发育成熟，有丝分裂活跃［26-27］。
当成牙本质细胞分泌第一次牙本质基质后，成釉细胞即进入分泌期。分泌期成釉细胞已完成终末分化，呈高柱状并呈现极性倒置：胞核位于近中间层方向、远离基底膜，核的近牙本质侧有许多成串的粗面内质网，平行于细胞长轴，高尔基复合体发达［28］。分泌期细胞最突出的特征是其远端的Tomes突起，成釉细胞通过Tomes突起向牙本质侧分泌大量的基质蛋白，随着釉基质厚度的不断增加，成釉细胞将远离釉质和牙本质［29］。
当釉质发育到一定厚度时，成釉细胞停止分泌釉基质蛋白，开始向成熟期转变，称为转化期［30］。尽管这一过程较为短暂，但细胞依然历经显著的极性变化，细胞变短并失去Tomes突起［31］。进入成熟期后，成釉细胞进一步变短，边缘光滑或带褶皱，分泌活动减弱，内吞分解的蛋白片段和水分，同时还向基质传输矿物盐［32］。进入成熟后期后，成釉细胞继续变短，呈扁平状，借半桥粒和基板附着在牙面上，最终退变为缩余釉上皮［33］。
2. 2 成釉细胞极性相关的分子及通路 在成釉细胞中研究较多的是Rho家族蛋白中的RhoA、Rac1和CDC42。在牙胚形态发生和成釉细胞分化过程中，RhoA在细胞中呈强阳性表达。在成釉细胞分化完成后，RhoA及其效应因子ROCKⅠ和ROCKⅡ的表达增强。RhoA通过Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil containing kinases，ROCK）信号转导通路来调节肌动蛋白微丝骨架的聚合，从而影响细胞的极性和形态。在牙胚的培养中，Rho家族蛋白抑制剂人艰难梭菌毒素A可完全抑制釉原蛋白的表达，提示RhoA在牙胚形态发生过程中发挥着重要作用［34］。RhoA在成釉细胞和成牙本质细胞中都表达，而Rac1仅表达于极化成釉细胞的基底膜侧［35］。无论是在牙胚形态发生还是成釉细胞分化过程，CDC42在整个牙发育过程的各个阶段都呈阳性表达［34］。
Otsu等［35］构建了牙上皮细胞特异性RhoA显性负性转基因鼠，与对照组相比，RhoA显性负性组小鼠切牙和磨牙均发育迟缓，尺寸偏小；成釉细胞和成牙本质细胞的极性丧失，细胞排列紊乱；E-钙黏蛋白（E-cadherin）、闭合蛋白（occludin，OCLN）和纤维型肌动蛋白（F-actin）的表达弥散，无规则；釉原蛋白（amelogenin，AMGN）表达降低，提示RhoA的活化对成釉细胞的极化和牙发育至关重要。该学者还对RhoA的上下游进行了研究，发现轴突导向蛋白4D（semaphorin 4D，Sema 4D）通过Plexin-B1/LARG复合体调节RhoA的活性，RhoA进一步通过ROCKⅠ调节成釉细胞的极化和增殖，通过Akt影响AMGN的定向分泌和成釉细胞分化［35］。其他RhoA下游分子（如mDia）也参与调节细胞极化过程中微管的稳定和延长［36］。
Rac1在大鼠磨牙发育过程中的表达模式与RhoA相似，在牙胚形态发生和成釉细胞分化过程中呈强阳性表达；在极化的成釉细胞中，Rac1表达增强，主要表达于远离基底膜侧的胞质中，并呈点状分布［37］。目前Rac1在成釉细胞极化过程中的作用尚未阐明。
研究发现，CDC42在发育中的成釉器呈高度动态的时空表达模式，在外釉上皮、星网状层和中间层中强烈表达。上皮特异性敲除CDC42的小鼠，在胚胎15.5 d时出现成釉器囊性病变；出生时，囊腔占成釉器的大部分，并伴有囊内红细胞积聚［16］。另有学者发现，上皮细胞特异性敲除CDC42的小鼠釉质较薄，切牙呈白垩色，磨牙萌出后易磨损，显微硬度和抗剪切力较正常组降低，扫描电镜显示釉柱结构紊乱［38］。尽管CDC42对成釉器的形成和牙发育具有显著影响，但上皮特异性敲除CDC42的小鼠目前均未发现成釉细胞极化出现异常，CDC42在成釉细胞极化过程中的作用有待进一步研究。
另外，基质金属蛋白酶20（matrix metalloproteinase 20，MMP20）和层粘连蛋白（laminin）等分子也证实与成釉细胞极性相关，但相应调控机制仍有待研究。MMP20是一种锌依赖性蛋白酶，是釉质发育早期和中期主要的釉基质蛋白降解蛋白。MMP20过表达小鼠在出生后第6天，颈环附近的成釉细胞极性丧失，细胞呈立方状或扁平状；在出生后第12天，成釉细胞极性消失，成釉细胞层排列紊乱［39］。层粘连蛋白是细胞黏着于基质的介质，可与多种基底膜成分结合，调节细胞生长和分化。层粘连蛋白α5（laminin α5，lam α5）表达缺失的小鼠的成釉器发育迟缓，内釉上皮层基底膜不连续，成釉细胞极性紊乱，釉结缺陷，牙上皮中Shh和Fgf4表达显著减少。原代细胞培养和牙胚器官培养实验进一步表明，lam α5在成釉细胞的增殖和极性形成中必不可少，lam-10/11通过整合素-α6β4和PI3K-CDC42/Rac途径调控牙胚大小和形态［40］。
3 成牙本质细胞极性及其相关的分子与通路
3. 1 成牙本质细胞的极性 成牙本质细胞是间充质来源细胞中极性最强的细胞，由牙乳头细胞分化而来，其分化有特定的时间、空间模式。成牙本质细胞在一生中持续分泌牙本质，以弥补釉质的自然磨耗，而极性特征的形成是成牙本质细胞分泌牙本质基质的先决条件。牙胚发育至钟状晚期时，在内釉上皮的诱导下，多角形的牙乳头外层细胞分化为前成牙本质细胞。前成牙本质细胞呈矮柱状，无发达的细胞器，也无极化特征［41］。而分化成熟的成牙本质细胞呈高柱状，胞核卵圆形，远离基底膜，细胞呈明显极性排列。高尔基复合体显著，位于近基底膜侧的胞质中，粗面内质网与细胞长轴平行，线粒体散在分布在细胞中，并可见空泡；细胞顶端形成牙本质细胞突，位于牙本质小管内［42］。成牙本质细胞之间有缝隙连接、紧密连接和中间连接相关所有复合体，但缺乏对紧密连接形成有重要意义的Crumbs 3，这种特殊的紧密连接使得成牙本质细胞对外部刺激存在防御反应［43-44］。
3. 2 成牙本质细胞极性相关的分子及通路 目前关于细胞极性的研究大多集中于上皮细胞，在间充质细胞中的研究较少，尤其是在成牙本质细胞中。由于牙齿的特殊发育模式，成牙本质细胞是人体内为数不多的可发生极性的间充质细胞之一，是细胞极化研究的优质模型。上皮-间充质相互作用是牙发育所必需的，非牙源性上皮启动成牙本质细胞极化：间充质组织首先促进非牙源性上皮向牙源性上皮转化，进而诱导成牙本质细胞分化［45］。但Ma等［46］构建的一种3D细胞外基质实现了成牙本质细胞不依赖上皮细胞信号即可在体外正常生长，这与上皮信号诱导成牙本质细胞极化的推论不相符。
RhoA在细胞分化阶段之前和期间在成牙本质细胞中表达，CDC42在钟状晚期及之后的成牙本质细胞的顶端呈高表达。而Rac1在起始阶段表达，在细胞分化阶段消失［47-48］。然而，Rho家族蛋白在成牙本质细胞极化中的确切作用仍不清楚。
相关信号通路和分子还涉及Wnt通路、Dlx3、GATA结合蛋白等。Wnt/β-连环蛋白信号通路在牙发育中不仅通过和骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子等介导EMT［49］，还对于成牙本质细胞维持平面极性至关重要。过度激活该通路导致前成牙本质细胞排列紊乱，且不分泌牙本质基质［50］。单纯过度激活β-连环蛋白的小鼠切牙成牙本质细胞去极化，表现为牙本质矿化不足、牙髓出现异位钙化。此外，该小鼠切牙中CDC42及其下游极性蛋白复合物Par3-Par6-aPKC的表达水平降低［51］。同源盒基因Dlx3敲除小鼠的成牙本质细胞极化降低，牙髓和牙本质矿化小管之间的排列无序。DNA结合转录因子GATA结合蛋白4缺陷小鼠的成牙本质细胞极性丧失，细胞变短、呈扁平形态［52］。上述通路或分子在成牙本质细胞极化过程中调节细胞骨架分布和细胞器重新定位的确切作用尚需进一步的研究。
4 牙发育中其他细胞极性相关分子及通路
Wnt信号通路中的受体蛋白Frizzled 6（FZD6）在许多胚胎发生过程中对于平面细胞极性的建立发挥着重要作用。FZD6在小型猪早期和晚期牙板中不对称表达，在牙板的唇侧有更强的表达，可见牙板在牙发育过程中也涉及平面细胞极性信号传导［53］。牙乳头细胞及其极化有助于牙齿形成、牙本质分泌和牙髓修复，然而相关分子机制仍然知之甚少。Luo等［54］研究发现，RhoA信号有助于JNK调节牙乳头细胞分化和极性形成。
5 总结与展望
细胞极性的形成和维持对于成釉细胞和成牙本质细胞的分化至关重要，是牙发育得以顺利进行的必要条件。以Rho家族蛋白为主的分子在这一过程中发挥重要作用，但具体机制及其调控分子尚不明确。成牙本质细胞极化是初级管状牙本质形成和牙本质组织再生的关键步骤，但目前关于成牙本质细胞极化的理解较为有限。利用成牙本质细胞模型，对于相关通路和分子网络的探究不仅有利于加深对间充质细胞极性的认识，还可为实现牙髓再生提供新思路［55］。
参考文献 略
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