【综述】牙釉质形成中的表观遗传学机制研究

牙发育是口腔上皮与外胚间充质相互作用的一系列复杂生物学过程。在胚胎第8周，口腔上皮细胞向间充质组织内增殖形成蕾状上皮结构——蕾状期成釉器。成釉器逐渐发育并形成帽状期和钟状期成釉器。钟状期成釉器分为4层细胞，即外釉上皮层、星网状层、中间层和内釉上皮层（inner enamel epithelium，IEE）。其中，IEE最终分化为具有形成牙釉质功能的成釉细胞。在牙釉质形成过程中，成釉细胞分为3个时期：前分泌期、分泌期和成熟期。钟状期成釉器IEE细胞呈立方形或矮柱状，核大且位于中央，并通过基底层与牙乳头相接。这些细胞不断增殖并覆盖整个牙胚冠部。当前期牙本质开始形成时，基底层降解，IEE细胞停止增殖并分化为高柱状的前分泌期成釉细胞。前分泌期成釉细胞极性改变，细胞核向中间层移动，形成大量蛋白质合成相关的细胞器，准备分泌牙釉质有机基质。分泌期成釉细胞形成具有分泌功能的托姆斯突，合成一系列釉基质蛋白（enamel matrix proteins，EMP）并将其分泌到未来的釉质沉积处，包括AMELX和非釉原蛋白，如ENAM、AMBN和釉丛蛋白（tufetlin），形成有序排列的牙釉质基质并开始矿化。在分泌期后，成釉细胞进入成熟期，分泌MMP20和激肽释放酶4（kallikerin-4，KLK4），调控和转运基质矿化所需的特定离子，形成高度矿化的牙体硬组织。最终成釉细胞在牙萌出过程中程序性凋亡。牙釉质是上皮组织来源的无细胞硬组织，受到损伤时无法修复再生。牙釉质形成调控机制的相关研究也因缺少牙上皮细胞而受到限制。

啮齿类动物（如小鼠）切牙根端的牙上皮干细胞（dental epithelial stem cells，DESC）使切牙牙釉质具有持续生长的特性。DESC位于切牙根端唇侧颈环（labial cervical loop，LaCL）内，周期性分裂形成IEE中的暂时性扩增细胞（transit-amplifying cell，TA）^［10］。这些TA也是成釉细胞的前体细胞，从切牙根端向切端依次分化形成具有不同功能的成釉细胞，包括前分泌期成釉细胞、分泌期成釉细胞和成熟期成釉细胞^［11］。小鼠切牙完整展现了牙釉质形成的各个阶段，是研究牙釉质形成调控机制的理想模型（图1）。

图1 小鼠下颌切牙根端唇侧颈环示意图

1.DNA甲基化：DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMT）的催化作用下，S-腺苷甲硫氨酸作为甲基基团供体，将甲基转移到基因组胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（cytosine-phosphorothioate-guanine，CpG）二核苷酸胞嘧啶5号碳原子上形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）。基因启动子区域募集甲基结合蛋白、改变核酸空间构象或影响核酸稳定性等方式抑制基因转录是DNA甲基化的主要调控机制。具有甲基转移酶活性的DNMT有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，这些DNMT可以分为两种：DNMT1是维持性DNMT，参与DNA复制中新合成链的DNA甲基化；从头DNMT包括DNMT3A和DNMT3B，主要调控基因组中CpG半甲基化，进而全甲基化TET（ten-eleven translocation）蛋白家族将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶，使 DNA去甲基化。

近年，学者们通过免疫组织化学、甲基化DNA免疫共沉淀芯片（methylated DNA immunoprecipition chip，MeDIP-chip）、甲基化DNA免疫共沉淀测序（methylated DNA immunoprecipition sequencing，MeDIP-seq）等研究手段，构建人或动物不同发育阶段牙胚组织及牙发育异常患者DNA甲基化修饰图谱，提示DNA甲基化在牙发育及牙发育异常中的调控作用。Su等^［12］应用MeDIP-seq检测小型猪钟状期（胚胎50 d）和分泌期（胚胎60 d）牙胚的全基因组DNA甲基化修饰状态，构建牙发育生物矿化过程中DNA甲基化修饰图谱。研究结果发现，2 469个差异甲基化基因，其中104个基因是生物矿化中潜在重要调控因子，包括磷酸肌醇-3-激酶催化亚基β肽基因（phosphoinositide-3-kinase，catalytic，beta polypeptide，PIK3CB）、磷酸肌醇-3-激酶催化亚基δ肽基因（phosphoinositide-3-kinase，catalytic，delta polypeptide，PIK3CD）、糖原合成酶激酶3β 基因（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）、促分裂原活化蛋白激酶10基因（mitogen-activated protein kinase 10，MAPK10）、Erb-B2受体酪氨酸受体激酶4基因（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 4，ERBB4）、胰岛素样生长因子1 受体基因（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）等基因。如GSK3β是经典Wnt信号通路的负调控因子，在牙形态发生中发挥着至关重要的作用，抑制GSK3β可延迟成釉细胞和成牙本质细胞分化。小型猪牙胚组织DNA甲基化动态修饰谱提示关键基因DNA甲基化修饰参与调控牙发育生物矿化过程。此外，MeDIP-chip构建的非综合征性先天性缺牙（non-syndromic tooth agenesis，NSTA）患者与牙列完整健康对照全基因组甲基化修饰谱表明，NSTA患者与对照组之间的DNA甲基化修饰水平存在差异。显著差异甲基化基因B细胞κ 轻肽基因增强子核因子抑制因子（β nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor beta，NFKBIB）、蛋白激酶C基因（δ protein kinase C，delta，PRKCD）、CACNA1A基因、AMPA离子能谷氨酸受体4基因（glutamate receptor，ionotrophic，AMPA 4，GRIA4）、内皮素受体B 基因（endothelin receptor type B，EDNRB）、N-甲基-D-天氡氨酸离子能谷氨酸受体2B 基因（glutamate receptor，ionotropic，N-methyl D-aspartate 2B，GRIN2B）、BH3 结合域死亡拮抗因子基因（BH3 interacting domain death agonist，BID）、HIST1H4D基因和HEY1基因不是NSTA的直接致病基因，但与软骨、骨和牙发育密切相关^［13］。这项研究初步揭示了DNA甲基化在个别牙先天缺失发生发展中的潜在作用，也拓展了人们对牙发育机制和牙发育异常病理机制的认识。在牙釉质形成过程中，5-mC在分泌期和成熟期成釉细胞核中呈点状分布，其表达水平在分泌期和成熟期差异无统计学意义；5-hmC在牙上皮细胞中广泛分布，表达水平从分泌期到成熟期逐渐上升^［8］。Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和TET家族蛋白基因在牙上皮组织中广泛表达，其中Dnmt1和Tet1在未分化牙上皮细胞（DESC和TA）中高表达，并随着成釉细胞程序性分化逐渐下降。DNA甲基化修饰的动态属性提示了其在牙釉质形成过程中的调控作用，DNMT1可通过维持DNA甲基化修饰水平调控牙上皮细胞的未分化状态，TET蛋白则通过对5-mC的羟基化作用参与调控整个成釉细胞分化过程。

2.组蛋白修饰：组蛋白的翻译后修饰是重要的表观遗传学机制，其动态属性在细胞命运选择中通常发挥着重要作用。组蛋白修饰多种多样，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和核糖基化等。组蛋白甲基化是研究最广泛的转录后修饰之一。组蛋白甲基化修饰与基因转录激活或抑制有关。组蛋白第3亚基4号赖氨酸（histone 3 lysine 4，H3K4）、H3K79和H3K36的甲基化修饰与基因转录激活相关，H3K9、H4K20和H3K27的甲基化修饰通常与基因转录抑制密切相关^［10］。转录抑制相关组蛋白甲基化修饰H3K27me3、甲基转移酶ZESTE增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，Ezh2）和去甲基酶JMJD3在小鼠磨牙发育过程中持续表达，其中JMJD3表达水平从钟状早期到晚期逐渐下降。转录激活相关修饰组蛋白H3 第4位赖氨酸的三甲基化修饰（histone 3 lysine 4 trimethylation，H3K4me3）及相关修饰酶含SET 域（赖氨酸甲基转移酶）7［SET domain containing（lysine methyltransferase）7，SET7］和赖氨酸特异去甲基化酶5B（lysine［K］-specific demethylase 5B，KDM5B）在小鼠磨牙发育过程中持续表达，表达水平具有动态变化特性。H3K4me3和H3K27me3以共价修饰的方式参与调控牙发育过程^［9，14］。H3K4me1、H3K4me3和相关甲基转移酶组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2D（lysine methyltransferase 2D，KMT2D）主要表达于小鼠磨牙牙胚成釉器中，与细胞增殖标志物Ki-67和细胞周期标志物pRb的表达模式相似，KMT2D介导的H3K4me1/3与牙釉质形成过程密切相关^［15］。H3K27me3和Ezh2在小鼠切牙牙源性上皮组织中均有显著的动态修饰特性：H3K27me3在干细胞和成釉细胞中高表达，TA中的表达水平较低；Ezh2的表达主要集中于TA中，Ezh2介导的H3K27me3在小鼠切牙牙釉质持续生长和再生中均具有重要的调控作用^［14］。

3.ncRNA：ncRNA是指由基因组转录而成的不编码蛋白质的 RNA 分子，包括小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），微RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等。ncRNA可不依赖转录机制而修饰RNA或蛋白质，在染色体结构、基因表达、蛋白质稳定性等方面发挥生物学功能^［16］。miRNA是一种短链非编码RNA，主要通过信使RNA转录后调控发挥生物学功能。Jheon等^［17］通过机械分离小鼠下颌切牙LaCL、舌侧颈环（lingual cervical loop，LiCL）和成釉细胞，进行miRNA芯片检测，构建了小鼠切牙不同牙上皮组织中miRNA时空特异性修饰谱，研究结果显示LaCL与LiCL存在26种差异表达miRNA，LaCL与成釉细胞存在35种差异表达miRNA。其中，miR-31在LaCL的表达水平显著高于LiCL，miR-318在成釉细胞中的表达水平显著高于LaCL，并指出这些差异表达的miRNA参与调控DESC增殖和成釉细胞分化等多个进程。Yin等^［7］构建了分泌期和成熟期成釉细胞miRNA修饰谱，研究结果显示miR-21、miR-31和miR-488在牙釉质成熟期特异性富集，miR-153和miR-31通过靶向作用牙釉质成熟相关基因溶酶体关联膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，Lamp1）和运铁蛋白受体（transferrin receptor，Tfrc）参与调控牙釉质成熟。

随着对表观遗传参与实现细胞功能和组蛋白动态修饰与酶之间关联理解的加深，进一步揭示了组蛋白甲基化修饰在牙釉质发育过程中的作用机制。甲基转移酶和去甲基化酶是实现时空特异性组蛋白甲基化动态修饰的重要调控因子。体内外敲低相关酶表达或干扰酶活性被广泛应用于组蛋白甲基化时空特异性修饰和作用机制的研究。KMT2D是负责H3K4me1/3的关键组蛋白转移酶之一，同时也被证实是歌舞伎面谱综合征（Kabuki syndrome）的主要致病基因^{［18, 19］}。KMT2D突变的患者常表现出各种牙发育异常，包括牙数目异常和牙形态异常^［20］。敲低牙上皮细胞系LS8细胞中KMT2D的表达水平可降低细胞增殖活性和细胞周期。RNA测序结果显示，Wnt信号通路是受KMT2D调控的重要信号通路之一。LS8细胞中敲低Kmt2d可减少β-联蛋白（β-catenin）的核转位和降低Wnt信号活性。Wnt信号通路激活剂氯化锂可部分逆转Kmt2d敲低细胞的核转位减少、增殖活性降低、细胞周期停滞及Wnt相关基因下调等表型。以上研究结果证实，KMT2D/H3K4me通过调节Wnt/β-catenin信号通路，在调控牙源性上皮细胞的增殖活性和细胞周期中发挥关键作用^［15］。ShhCreER；Ezh2^fl/fl转基因小鼠条件性敲除牙源性上皮组织中Shh阳性细胞中Ezh2，可研究Ezh2/H3K27me3在DESC命运选择及牙釉质形成中的调控作用。研究结果发现，ShhCreER；Ezh2^fl/fl小鼠切牙未见明显牙釉质发育缺陷表型，但切牙上皮组织出现结构紊乱、牙釉质基质沉积异常，以及Sox2、Ki-67、Amelx异位表达，提示Shh启动子区域Ezh2/H3K27me3转录后调控Shh的表达水平，精确把控牙上皮细胞命运选择，进而维持小鼠切牙牙釉质形成稳态。同时，条件性敲除Ezh2可导致牙釉质损伤修复过程中牙釉质矿化沉积推迟和牙釉质再生减缓，提示损伤修复过程中Ezh2/H3K27me3修饰时空动态改变可抑制Shh表达，从表观遗传修饰层面干扰DESC命运选择，最终影响牙釉质修复和再生进程^［21］。

DICER1是miRNA形成过程中的关键酶，体内条件性敲除Dicer1的转基因小鼠是研究miRNA在牙釉质形成中调控作用的重要方式。Pitx2Cre；Dicer1^fl/fl小鼠牙胚成釉器IEE细胞极化异常，成釉细胞分化受阻，釉原蛋白和成釉蛋白分泌显著减少，并且出现牙釉质厚度降低的牙釉质形成缺陷表型。K14Cre；Dicer1^fl/fl小鼠切牙牙釉质出现点状和沟状缺陷，磨牙则出现牙尖结构异常，提示miRNA在牙釉质形成中牙上皮细胞增殖、成釉细胞分化、牙尖形态发育和矿化成熟等多个阶段均具有一定的调控作用^［22］。条件性敲除Dicer1小鼠证实了整体miRNA在牙釉质形成中的调控作用，而敲除单一miRNA的转基因小鼠、化学制剂Agomir和Antagomir的应用拓宽了单个/簇miRNA特异性功能的研究思路。通过构建miR-200C/141^-/-转基因小鼠的研究发现，小鼠切牙LaCL上皮细胞间连接存在缺陷，牙釉质基质分泌减少，基质矿化程度降低，提出miR-200c/141在牙釉质形成中DESC分化、基质分泌、成熟矿化等多个阶段中均具有重要的调控作用^［22］。利用miR-214 Antagomir干扰小鼠下颌磨牙发育，发现抑制miR-214表达可下调Enam、Amelx和钙结合蛋白（calbindin 1，Calb1）等牙釉质形成关键基因的表达水平，导致产生牙釉质形成缺陷的表型，表现为釉柱结构紊乱和抗酸蚀能力下降，提示miR-214与牙釉质形成密切相关^［23］。Fan等^［24］研究发现，小鼠切牙根端注射miR-224 Agomir导致小鼠切牙出现釉柱结构紊乱和硬度下降等牙釉质矿化不全表型。miR-224通过抑制成釉细胞离子通道碳酸氢钠协同转运蛋白4-A4（solute carrier family 4，sodium bicarbonate cotransporter，member 4，SLC4A4）和囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的表达，参与调控牙釉质矿化过程。因此，miRNA通过对保守信号通路的精确调控在牙釉质形成的各个阶段都发挥了重要的调控作用。

Wang等^［13］在构建先天性牙缺失患者和牙列完整健康对照的全基因组DNA甲基化修饰谱的基础上，通过GO分析和KEGG分析，进一步确定了NFKBIB、PRKCD、CACNA1A、GRIA4、EDNRB、GRIN2B、BID、HIST1H4D和HEY1共9个候选基因。上述基因甲基化修饰状态的改变精确调节了包括神经发生和牙齿发育在内的复杂信号通路网络，如MAPK、Notch、NF-κB和Wnt/Ca²⁺通路，从而使牙源性细胞中局部信号传导时空性表达的微小变化被级联放大，产生了表型重大改变的“蝴蝶效应”。

以上研究均证实牙釉质形成过程中的表观遗传修饰，如组蛋白甲基化和miRNA，影响关键基因转录，精确调控基因时空特异性表达，最终保证牙上皮细胞命运选择并触发正常牙釉质形成级联反应（图2）。不同于组蛋白甲基化和miRNA调控机制研究的广度和深度，DNA甲基化相关仍停留在修饰图谱构建，相关机制研究仍有待进一步深入。

图2 表观遗传修饰在牙釉质形成过程中的调控作用示意图

牙釉质形成有赖于关键基因的程序性表达。表观遗传修饰在基因程序性表达中发挥着重要作用。表观遗传修饰异常可导致基因表达紊乱、牙上皮细胞功能异常以及牙釉质形成缺陷。Yin等^［25］对大鼠分泌期和成熟期成釉细胞中分离的RNA样本进行全基因组miRNA和mRNA转录组分析，发现miR-153在前分泌期和分泌期成釉细胞中的表达水平显著高于成熟期。miR-153可直接作用于Lamp1、Cltc、Clcn4和Slc4a4的3′-UTR。小鼠出生后第8天下颌第一磨牙局部注射miR-153，观察到牙釉质矿化程度显著降低的AI表型。Cltc和Lamp1是大鼠切牙中成熟期成釉细胞内吞和内体/溶酶体途径的标志基因，成熟期成釉细胞分泌蛋白酶消化的EMP碎片在细胞内吞小体/溶酶体系统内进一步降解，是牙釉质成熟的关键阶段。该研究指出miR-153通过靶向作用内吞小体/溶酶体途径的关键基因参与调控釉质成熟阶段，是AI发生的潜在致病基因。

DDE也是先天性疾病颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia，CCD）的一种常见临床表现，该疾病主要由6p21染色体上的Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）基因突变引起。Chang等^［26］采用miRNA芯片分析过表达突变Runx2（3种突变体：R190W、R225Q、A362V）LS8细胞中差异表达的miRNA，发现miR-185-5p显著上调，且miR-185-5p过表达显著下调LS8细AMEL、ENAM、KLK4和 Mmp20表达。进一步研究发现，miR-185-5p通过靶向作用Dlx2 3′UTR抑制其表达，最终导致DDE。miRNA表达紊乱可影响基因转录表达，导致牙釉质形成缺陷。

除少数病因明确的DDE（AI、氟牙症或四环素牙），临床中大多数DDE病例致病因素及发病机制尚不明确。目前，大多数DDE被认为是由遗传、环境、全身情况等多种因素共同参与和（或）相互作用引起的多因素疾病。表观遗传修饰为环境因素相关DDE提供了机制基础。表观遗传修饰使牙釉质形成关键基因表达对环境变化敏感，也使表观遗传修饰成为环境因素与基因表达之间的桥梁。磨牙-切牙釉质矿化不全（molar-incisor hypomineralization，MIH）是DDE的一种，系指全身因素引起一个或一个以上的第一恒磨牙釉质矿化不全，常伴切牙受累。MIH病因尚不明确，近年来，借助高通量测序技术及MeDIP-chip的研究极大推进了MIH的表观遗传学机制研究。Mj等^［27］借助MeDIP-chip对磨牙矿化不全患儿和健康儿童脐带血进行全基因组DNA甲基化修饰检测分析，发现24个差异甲基化基因与牙釉质矿化不全密切相关，包括G蛋白偶联受体123基因、乙酰辅酶A乙酰转移酶2、MIR25、微染色体维持缺陷7、肿瘤抑制半可转移候选基因4、细胞色素P4501A1、HIST1H4C、糖体蛋白S6激酶、微管蛋白D1等。Tynior等^［28］通过颊黏膜拭子收集MIH儿童与健康儿童的颊黏膜上皮细胞，通过5-mC DNA 酶联免疫吸附测定试剂盒检测其DNA甲基化水平，结果表明两组间差异无统计学意义。进一步分析MIH潜在病因与DNA甲基化水平之间的关联发现，怀孕次数、分娩次数、分娩类型、水痘感染和高烧（3岁以下）与DNA总甲基化水平差异相关。这些研究结果提示，异常DNA甲基化修饰是MIH潜在发病机制，但具体机制仍有待进一步研究。

流行病学研究结果指出，母亲妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）与儿童DDE 患病率呈正相关^{［29, 30］}。牙釉质形成始于胚胎第15周，在此期间母体的代谢紊乱极易影响牙釉质形成^［31］。孕妇血液中过量的葡萄糖可引发胎儿DNA甲基化修饰状态改变，进而影响其牙釉质形成相关的蛋白质分泌^{［32, 33］}。Chen等^［34］建立GDM大鼠模型并发现子代切牙出现DDE表型。高糖环境使脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，Apex1）表达上调。Apex1通过ERK和JNK信号通路上调DNMT1表达，提高干细胞关键基因八聚体结合转录因子4基因（octamer binding transcription factor 4，Oct4）和Nanog启动子区域DNA甲基化修饰水平，使 Oct4和Nanog表达水平下调，抑制DESC增殖和自我更新，最终导致牙釉质缺陷。

环境内分泌干扰物双酚A（bisphenol A）是DDE的相关因素之一^［35］。Li等^［35］建立了小鼠孕期双酚A暴露动物模型，结果显示孕期双酚A暴露小鼠子代出现切牙长度变短、牙釉质密度降低、釉柱微结构紊乱和牙釉质矿化沉积点推迟等DDE表型。母鼠孕期双酚A暴露导致子鼠切牙LaCL中增殖细胞增加，并伴有转录抑制相关组蛋白甲基化H3K27me3在LaCL异常富集。ChIP-seq构建双酚A暴露小鼠DESC中H3K27me3修饰图谱。研究结果显示，双酚A暴露组的H3K27me3在基因启动子区的修饰水平显著高于对照组，其中DESC关键基因Lrig1启动子区域H3K27me3修饰水平显著提高，导致Lrig1转录抑制、牙上皮细胞异常增殖以及牙釉质发育缺陷（图3）。

图3 表观遗传动态修饰在牙釉质发育缺陷中的作用示意图

与分子生物学的发展由单个基因的研究进入全基因组的基因组学时代相似，学者们构建了不同生物、不同组织细胞及不同生理状态下的多种表观遗传修饰图谱，将表观遗传学研究推进到“全景式”的研究阶段。表观遗传修饰作为隐藏在基因组上的另一套遗传密码，破译与分析其信息及功能无疑将促进并深化对生长发育、疾病发生等重要生命活动调节机制的认识。高通量测序实现了甲基化修饰位点的全面分析，测定组蛋白甲基化修饰时空特异性动态变化，帮助人们更好地探索其在牙釉质形成中调控机制。以组蛋白修饰酶、DNA甲基化酶、miRNA分子为代表的表观遗传学修饰分子是牙釉质形成过程中的一组动态调节因子，它们构成奇妙的信号网络，形成并维持丰富而有序的表观遗传学修饰，在不改变DNA序列的情况下决定牙上皮细胞命运，发挥其精确的调节作用。本文总结了表观遗传修饰在牙釉质形成及DDE发生过程中的调控机制，但仍有待来自体外和体内功能研究的新证据逐步阐明表观遗传动态修饰调控DDE发生的相关机制，并据此为DDE的发病机制和潜在的预防或治疗干预措施提供新的见解。