引用本文：孔境崧，王敏，金伟秋，等.伴2型糖尿病牙周炎患者唾液菌群特征分析[J].中国实用口腔科杂志，2024，17（2）：199-205. DOI：10.19538/j.kq.2024.02.012
摘要：目的 分析伴2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）牙周炎患者的唾液菌群组成及多样性变化。方法 收集2022年3—12月于南京大学医学院附属口腔医院牙周病科就诊的18例血糖浓度在正常范围内的牙周炎患者（P组）及19例伴T2DM牙周炎患者（DP组）在非刺激状态下的全唾液样本，行16S rRNA高通量测序。通过α多样性分析、β多样性分析和线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）方法比较2组菌群多样性及组成差异，并分析代谢通路丰度差异，以及菌群丰度与空腹血糖浓度的相关性。结果 DP组Faith′s PD指数和Observed species指数显著高于P组，差异具有统计学意义（Z值分别为-3.130、-2.218，均P < 0.05）；而2组其他α多样性指数比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。β多样性分析显示2组唾液菌群各自聚类且可明显区分。LEfSe分析结果显示，DP组中放线菌门等为显著优势菌，梭杆菌门、互养菌门等为P组的显著优势菌（均P < 0.05）。代谢通路分析结果显示，2组在葡萄糖氧化降解、多黏菌素抗性、氨基酸和胆碱酯酶代谢等通路丰度表达差异有统计学意义（均P < 0.05）。放线菌门、梭杆菌门、互养菌门等丰度与空腹血糖浓度显著相关（均P < 0.05）。结论 相对于牙周炎患者，伴T2DM牙周炎患者唾液菌群组成及菌群代谢通路发生特征性改变，其可能与T2DM的发展相关。
关键词：2型糖尿病；慢性牙周炎；唾液菌群；16S rRNA
牙周炎是由菌斑微生物引起的多因素感染性疾病，导致牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）破坏。牙周炎与多种系统性疾病相关，其中牙周炎与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的关系一直是研究的热点［1］。目前研究表明，糖尿病患者患牙周炎的风险是非糖尿病患者的3倍［2］，而牙周状况同时也会影响糖尿病患者的血糖控制及预后［3］。经有效的牙周治疗后，糖尿病患者的血糖浓度显著改善，有研究显示伴T2DM牙周炎患者行龈下刮治和根面平整术3个月后，患者血清中内脂素和糖化血红蛋白水平均显著下降［4］。
口腔微生物在牙周炎和T2DM的发生发展中均发挥着不可或缺的作用［5］。研究发现1型或2型糖尿病患者的龈下菌斑微生物与健康对照组相比存在显著差异［6］。一项针对老年患者的研究显示，高血糖患者表现出唾液菌群微生态失调和相关代谢表型的恶化，潜在疾病相关细菌属（纤毛菌属、葡萄球菌属、卡托菌属和布雷德菌属）显著富集［7］。然而，关于伴糖尿病牙周炎患者唾液菌群的变化，目前尚无统一定论。Sun等［8］研究表明，与健康对照组相比，T2DM患者唾液微生物群的多样性显著增加，牙周致病菌及普雷沃菌等的比例显著增加。但也有研究结果显示，T2DM患者唾液微生物多样性降低，部分菌属的丰度增加，但在T2DM和牙周病共存时减少［9］。Shaalan等［10］研究结果支持T2DM患者唾液微生物的丰富度和多样性降低，但认为优势菌属没有显著差异。另有研究表明，除了细菌多样性及菌群构成的变化，T2DM患者菌群微生物的细胞运动和功能代谢相关的多条途径发生改变［11］。此外，血糖浓度被认为与部分细菌（如乳杆菌等）的表达存在相关性［12］。因此，本研究旨在通过16S rRNA测序探究伴T2DM的牙周炎患者唾液菌群组成及多样性改变，并分析其与空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）浓度的相关性，为进一步探讨T2DM和牙周炎的关联机制提供理论基础。1. 1 研究对象与分组 选取2022年3—12月于南京大学医学院附属口腔医院牙周病科就诊的18例血糖浓度在正常范围内的牙周炎患者（P组）及19例伴T2DM的牙周炎患者（DP组）作为研究对象。P组男12例，女6例，年龄（51.9 ± 9.9）岁；DP组男14例，女5例，年龄（51.8 ± 12.0）岁；2组患者性别构成、年龄比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。本研究经南京大学医学院附属口腔医院伦理委员会审批（批准号：NJSH-2021NL-91），研究过程严格遵循《赫尔辛基宣言》。所有患者均签署知情同意书。DP组纳入标准：①年龄18 ~ 75岁；②口内至少余留18颗天然牙；③按照世界卫生组织于2010年公布的糖尿病诊断标准诊断为T2DM：典型三多一少的临床症状（烦渴多饮、多食、多尿、不明原因体重下降），且随机血糖浓度≥ 11.1 mmol/L、FBG ≥ 7.0 mmol/L或空腹口服75 g葡萄糖后2 h血糖浓度≥ 11.1 mmol/L，且病程1年以上；④无脑卒中、心绞痛、心肌梗死、肾病等严重糖尿病并发症；⑤依据2017年美国牙周病学会（AAP）与欧洲牙周病学联盟（EFP）研讨会上提出的牙周炎的分类标准（以下简称“牙周炎新分类标准”）诊断为牙周炎［13］：在≥ 2颗非相邻牙齿检测到邻面的临床附着丧失，或在≥ 2颗牙齿上检测到≥ 3 mm的颊面或舌（腭）面临床附着丧失且牙周袋深≥ 3 mm，但观察到的临床附着丧失不能归因于与牙周炎无关的原因。P组纳入标准：①年龄18 ~ 75岁；②口内至少余留18颗天然牙；③依据牙周炎新分类标准诊断为牙周炎［13］；④无糖尿病病史，且空腹血糖浓度为3.9 ~ 6.1 mmol/L。2组排除标准：①患有系统性疾病，如胃肠、肾脏、肝脏、心脑血管及免疫系统疾病等；②6个月内有特殊药物（如抗生素或激素）治疗史；③6个月内接受过牙周治疗；④怀孕或哺乳期。
1. 2 血糖测定、唾液样本收集及DNA提取 嘱患者在采集样本前一晚刷牙后，勿进食、饮水，勿刷牙、漱口，次日上午采集患者早餐前静脉血，测量FBG；同期收集唾液样本，收集流程如下。患者手持50 mL离心管，每隔2 min将口内无刺激状态下的唾液吐入离心管中，嘱患者切忌吸吮，以免刺激牙龈出血，收集至少2 mL未经刺激的全唾液，立即保存在-80 °C冰箱中。采用MagPure DNA提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）提取DNA。在0.8%琼脂糖凝胶上电泳进行分子大小判断，利用紫外分光光度计（Thermo Scientific Scientific，美国）对DNA进行定量。1. 3 高通量测序 选用细菌16S rDNA V3 ~ V4区特异性引物（引物序列为338F：5′-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）进行PCR扩增。PCR采用NEB Q5 DNA高保真聚合酶，PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳回收目的片段。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay试剂盒（Invitrogen，美国）对PCR扩增产物在Microplate reader（Molecular Devices，美国）上进行定量，然后按照每个样本所需的数据量进行混样。使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep（Illumina，美国）建立文库。在Agilent Bioanalyzer（Agilent，美国）上用Agilent High Sensitivity DNA试剂盒（Agilent，美国）对文库进行质检。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay试剂盒（Invitrogen，美国）在Promega QuantiFluor（Promega，美国）上对文库进行定量，合格的文库计算后浓度应在2 nmol/L以上。在Illumina NovaSeq（Illumina，美国）上利用NovaSeq 6000 SP Reagent试剂盒（500cycles）（Illumina，美国）进行双端测序。1. 4 生物学分析 对原始序列划分文库和样本，并去除barcode序列。使用Vsearch软件将原始数据进行处理，进行DADA2序列质控后获得ASV序列或称为OTU代表序列（ASV/OTU），所有数据依据ASV/OTU丰度表进行。选用Silva数据库（Release132），在QIIME2软件中使用Naive Bayes分类器进行不同物种分类的注释并展示。根据物种分类注释结果，统计各样本中域、门、纲、目、科、属、种7个分类的物种组成差异及相对丰度。在派森诺基因平台使用R语言及QIIME软件进行生物学信息分析。α多样性分析：以Chao1和Observed species指数分析丰富度，以Shannon和Simpson指数分析多样性，以Faith′s PD指数分析基于进化的多样性，以Pielou′s evenness指数分析均匀度，以Good′s coverage指数分析覆盖度。β多样性分析：使用基于jaccard距离的主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）的排序分析及层次聚类分析的方法。使用线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）方法分析物种组成的差异分布。使用PICRUSt2工具基于2组样本中的标记基因序列丰度来预测样本代谢通路丰度。1. 5 统计学处理 应用SPSS 24.0软件对数据进行统计学分析。采用K‑S检验分析数据是否服从正态分布。正态分布的计量资料以“均数±标准差”表示，非正态分布的计量资料以“中位数（四分位数）［M（P25，P75）］”表示。采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验比较2组菌群多样性、组成差异及代谢通路丰度差异，采用Mann-Whitney U检验比较2组FBG浓度，采用Spearman相关系数分析菌群丰度与FBG浓度的相关性。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 1 α多样性及β多样性分析 α多样性分析结果表明，DP组Faith′s PD指数和Observed species指数显著高于P组，差异具有统计学意义（Z值分别为-3.130、-2.218，P值分别为0.002、0.027），而2组Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、Pielou′s evenness指数、Good′s coverage指数比较，差异均无统计学意义（Z值依次为-1.854、-1.307、-0.729、-0.851、-1.580，均P > 0.05）。见图1。
β多样性分析结果表明，基于jaccard距离的PCoA分析和层次聚类分析，通过点与点间的距离体现组间微生物群落结构的相似性，结果显示2组各自聚类且可明显区分开，说明2组群落结构显著不同。见图2。
2. 2 菌群组成分析 DP组测得18 944个OTUs，P组测得12 817个OTUs，其中有2780个OTUs为2组所共有。对2组患者唾液菌群行LEfSe分析，制作LDA值分布柱状图及cladogram图（图3）。门水平上，放线菌门在DP组患者唾液菌群中丰度更高，梭杆菌门和互养菌门在P组患者唾液菌群中丰度更高；纲水平上，放线菌纲、芽胞杆菌纲、红蝽菌纲在DP组患者唾液菌群中丰度更高，在P组患者唾液菌群中梭杆菌纲、依普西隆变形菌纲、互养菌纲丰度更高；目水平上，放线菌目、红蝽菌目、棒杆菌目、乳杆菌目在DP组患者唾液菌群中丰度更高，而梭杆菌目、弯曲杆菌目、互养菌目在P组患者唾液菌群中丰度更高；科水平上，放线菌科、肠杆菌科、微球菌科、丛毛单胞菌科、肉杆菌科、棒杆菌科、链球菌科、假单胞菌科在DP组患者唾液菌群中丰度更高，梭杆菌科、弯曲杆菌科和互养菌科在P组患者唾液菌群中丰度更高；在属水平上，DP组患者唾液菌群中放线菌属、链球菌属、罗斯菌属、短链小球菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、口腔杆菌属、爱格士菌属、代尔夫特菌属丰度更高，P组患者唾液菌群中梭杆菌属、斯尼思菌属、弯曲杆菌属、团聚杆菌属和依赖杆菌属丰度更高；以上2组间差异均有统计学意义（均P < 0.05）。其余微生物的种类在2组患者的唾液菌群中丰度较为相似。
2. 3 代谢通路丰度分析 2组具有显著性差异的代谢通路：参与葡萄糖氧化降解通路DHGLUCONATE-PYR-CAT-PWY，甲醇氧化成二氧化碳通路PWY-7616，多黏菌素抗性相关通路PWY0-1338，参与色氨酸、鸟氨酸代谢通路PWY-5651、NADSYN-PWY和ORNDEG-PWY，与胆碱酯酶代谢相关通路ALL-CHORISMATE-PWY，参与香兰素降解通路PWY-7098、PWY-6338和PWY-7097，合成甲萘醌相关通路PWY-5850、PWY-5896和PWY-5845，参与合成去甲酚-6和去甲酚-9通路PWY-5860、PWY-5862，苯甲酰辅酶降解通路PWY-1361，蛋氨酸降解通路PWY-4361，蛋氨酸循环通路PWY-7527；且以上代谢通路中基因丰度DP组均高于P组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。2. 4 关联性分析 DP组的FBG为6.3（5.97，7.00）mmol/L，P组FBG为5.19（4.96，5.40）mmol/L，组间差异具有统计学意义（Z = -5.199，P < 0.001）。将P组与DP组唾液菌群丰度与其FBG行相关性分析发现，门水平上，放线菌门、Gracilibacteria_（GN02）与FBG浓度呈显著正相关，梭杆菌门、互养菌门与FBG浓度呈显著负相关（均P < 0.05）；纲水平上，放线菌纲、芽孢杆菌纲与FBG浓度呈正相关，而梭杆菌纲、互养菌纲等与FBG浓度呈负相关（均P < 0.05）；目水平上，放线菌目、乳杆菌目等与FBG浓度显著正相关，梭杆菌目、弯曲杆菌目、互养菌目等与FBG浓度显著负相关（均P < 0.05）；科水平上，链球菌科、放线菌科、乳杆菌科等与FBG浓度显著正相关，梭杆菌科、互养菌科、弯曲杆菌科等与FBG浓度显著负相关（均P < 0.05）；属水平上，链球菌属、乳杆菌属、放线菌属等与FBG浓度显著正相关，梭杆菌属、团聚杆菌属等与FBG浓度显著负相关（均P < 0.05）。见图4。
龈下菌斑与牙周炎关系密切，可用来反映牙周状况，但牙周状况也受唾液中微生物的影响［14］。相关研究表明，尽管唾液菌群与龈下菌斑存在差异，但在反映患者牙周状况时，唾液菌群微生物构成的变化仍可体现患者口腔健康状况。而相较于龈下菌斑，唾液菌群的取样具有无痛、无创、方便的优势［15］。因此，对不便于行龈下菌斑取样的患者，唾液检测可能成为一种简便的口腔健康状况监测和评估手段。此外，目前认为唾液菌群与肠道菌群具有相关性，可能在牙周疾病与全身疾病的联系中发挥重要作用。
口腔微生物存在密集的关系网络，口腔疾病如牙周炎可能是多种微生物相互作用的结果［16］。尽管已有研究比较了伴T2DM牙周炎患者与单纯牙周炎患者唾液及龈下菌斑中牙周致病菌的差异［17］，但对其他微生物的研究尚无文献报道。本研究通过16S rRNA测序探究伴T2DM的牙周炎患者与单纯牙周炎患者唾液菌群组成及多样性的改变，以及其与FBG浓度的关系，为T2DM与牙周炎关联机制研究提供方向。
本研究结果表明，P组与DP组的唾液菌群在多样性上差异不明显，尤其表征多样性（Shannon和Simpson指数）、均匀度（Pielou′s evenness指数）和覆盖度（Good′s coverage指数）的组间差异均无统计学意义。但2组唾液菌群组成差异显著，相对于P组，DP组放线菌门/纲/目/科/属、芽胞杆菌纲、乳杆菌目、链球菌科/属、微球菌科、罗斯菌属、肉杆菌科、短链小球菌属、红蝽菌纲/目、棒杆菌目/科/属、假单胞菌科/属、口腔杆菌属、爱格士菌属、代尔夫特菌属、肠杆菌科及丛毛单胞菌科占据优势；相对于DP组，P组梭杆菌门/纲/目/科/属、斯尼思菌属、依普西隆变形菌纲、弯曲杆菌目/科/属、团聚杆菌属、互养菌门/纲/目/科和依赖杆菌属表现为优势菌。尽管这些并非全是牙周炎或糖尿病的致病菌，但提示这些存在显著性差异的菌属可能是潜在的益生菌或在维持菌群平衡中起到重要的作用。
目前研究表明，伴糖尿病牙周炎患者口腔微环境中葡萄糖浓度升高、宿主免疫系统受损［18］，这可能是本研究结果中DP组唾液菌群葡萄糖的氧化降解通路丰度上调的原因。而唾液菌群在这个通路上的改变可能进一步成为糖尿病影响牙周健康，以及牙周感染影响血糖控制的机制之一［19］。本研究还表明，DP组唾液菌群中部分氨基酸（如色氨酸、鸟氨酸等）代谢通路丰度出现了显著性上调。有研究分析了伴或不伴糖尿病牙周炎患者龈下微生物组的代谢表达，认为氨基酸表达差异可能是由于内毒素通过口腔-肠轴诱导，使先天性免疫系统长期过度激活所致［20］。而色氨酸的部分代谢产物被认为是肠道中芳香烃受体的配体，可在肠道稳态中起到重要作用，参与炎症性肠病的发生机制，也影响T2DM的发生发展［21］。这说明了口腔唾液菌群可能通过肠道影响全身健康。此外，本研究也发现了2组在多黏菌素抗性上的区别。多黏菌素抗生素大多作为对抗多重耐药细菌一线治疗的最后选择，对革兰阴性菌表现出很强的杀菌活性；但由于耐药菌株及对多黏菌素有内在抗性的菌种存在，多黏菌素抗性正变得越来越普遍，而在大部分革兰阴性菌中多黏菌素抗性机制涉及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）结构的变化［22］；而LPS正是牙周菌斑微生物引发牙龈炎及牙周炎的一种重要的内毒素，在体内可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，合成和释放多种细胞因子和炎性介质［23］。在糖尿病患者唾液菌群中多黏菌素抗性的增加可能与口腔菌群组成的改变或长期用药相关。这些结果尚需要进一步的研究，如通过靶向代谢组学进一步定量分析，从而深入探究糖尿病影响牙周炎唾液菌群的具体机制。
有研究表明，伴糖尿病牙周炎患者经牙周非手术治疗后，唾液菌群组成发生了改变，治疗后1.5个月唾液样本中拟杆菌门相对丰度降低，治疗后3个月恢复至基线水平；而放线菌门在治疗后1.5个月相对丰度较基线升高，但在治疗后3个月下降［24］；且牙周非手术治疗能够改善糖尿病患者血糖，这提示菌群组成改变可能与血糖的变化存在联系。本研究从多个层级分析P组与DP组唾液菌群丰度与患者FBG浓度的相关性，发现了多种菌群（如放线菌属、梭杆菌属、乳杆菌属等）与FBG浓度呈现显著相关性。这说明随着T2DM的发展，唾液菌群组成可能持续发生改变，而唾液菌群的改变也可能影响着T2DM的发展。
综上，本研究结果表明T2DM患者的唾液菌群组成发生了特征性改变，放线菌门等为显著优势菌，放线菌门、梭杆菌门、互养菌门等与FBG浓度显著相关，唾液菌群特征性改变可能与伴糖尿病牙周炎的发生发展存在关联。然而，本研究存在一定的局限性，仅研究了2组患者唾液菌群之间的区别，并没有分析T2DM与菌群组成改变的因果关系，需要进一步纵向研究进行验证；本研究未分析牙周炎具体指标如临床附着丧失等，血糖指标也仅分析了FBG浓度，对牙周炎和血糖指标与菌群组成改变的相关性需深入探索；本研究局限于在微生物构成分析，其结论需更多针对致病微生物的基因组成、毒力因子及代谢产物等的研究以明确作用机制。
