【论著】肝组织细胞外囊泡调节间充质干细胞成骨分化促进小鼠颌骨缺损愈合初探
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作者：李成汉 雷啸 郑晨曦 金岩 隋秉东 英司奇
通信作者：英司奇
作者单位：第四军医大学基础医学院（李成汉）；第四军医大学口腔医院组织工程研发中心 口颌系统重建与再生全国重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 陕西省口腔疾病国际联合研究中心（雷啸、郑晨曦、金岩、隋秉东、英司奇）
引用本文：李成汉, 雷啸, 郑晨曦, 等. 肝组织细胞外囊泡调节间充质干细胞成骨分化促进小鼠颌骨缺损愈合初探[J]. 中华口腔医学杂志, 2024, 59(5): 435-443. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20240224-00087.
目的
探讨肝组织细胞外囊泡（LT-EV）促进间充质干细胞成骨分化并治疗小鼠颌骨缺损的生物学过程，以期为临床颌骨缺损治疗提供一种可行的治疗方式。
方法
使用酶解法和差速离心法提取小鼠LT-EV，使用扫描电镜、蛋白质印迹法和纳米粒子跟踪分析仪鉴定和表征LT-EV，并通过蛋白质组学、京都基因和基因组数据库通路分析进一步探索LT-EV的生物学功能。使用流式细胞术检测LT-EV血浆浓度，计算LT-EV的血浆半衰期。使用小动物活体成像系统检测小鼠注射LT-EV 24 h后的生物学分布。通过简单随机抽样法将6只C57BL/6小鼠分为对照组和LT-EV组（每组3只），所有小鼠行颌骨缺损手术，每7天行尾静脉注射（对照组注射磷酸盐缓冲液，LT-EV组注射LT-EV），术后28 d使用显微CT检测小鼠颌骨愈合程度，通过HE染色分析LT-EV的多器官生物安全性，使用免疫荧光染色检测颌骨缺损区域成骨标志蛋白表达量。采用LT-EV处理成骨分化诱导的人颌骨间充质干细胞（hJBMSC）（取自第四军医大学口腔医院创伤与正颌外科提供的正颌手术患者手术切除的正常颌骨骨片），并比较hJBMSC组与对照组（磷酸盐缓冲液处理）细胞成骨分化能力差异，通过碱性磷酸酶（ALP）染色和实时荧光定量PCR验证LT-EV的体外促成骨分化作用。
结果
LT-EV产量较高，蛋白组学与京都基因和基因组数据库通路分析显示，LT-EV含有调节细胞生物功能的系列蛋白质。尾静脉注射的LT-EV可到达小鼠颌骨缺损区域，并促进颌骨缺损的再生修复［LT-EV组和对照组骨体积分数分别为（36.06±4.20）%和（18.58±5.61）%；t=4.32，P=0.013］，且具有良好的生物安全性。LT-EV在体外可以促进hJBMSC成骨分化，相比对照组，hJBMSC组成骨分化后ALP染色和成骨基因表达水平均显著增强（P<0.05）。
结论
LT-EV产量大、易获取、生物安全性高并具备优良的促成骨作用，有望成为颅颌面骨骼缺损再生的无细胞疗法新策略。
肿瘤、外伤和感染等因素均可造成颌面部骨骼缺损，影响患者口颌功能、颜面美观和心理健康［1］。临床上的治疗方法，如自体骨或合成骨替代材料，虽有一定效果但仍有诸多限制，如二次创伤、供体骨量有限以及存在生物相容性等问题［2］。细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）可携带核酸、蛋白质和代谢产物等生物活性物质，是一种重要的细胞间和器官间交流的通讯工具［3, 4］。同时，非干细胞来源的EV在组织再生治疗中的作用越来越受到关注［5］。值得注意的是，若从原代细胞开始到获得足够产量的培养基来源EV需要7~14 d，而获取动物组织来源EV仅需几个小时，可降低EV的获取成本。此外，动物组织来源EV还具有产量较大、制备容易和成本较低等特点，是一种优质的内源性EV［6］。
肝脏组织天然具有强大的再生能力，例如对小鼠行三分之二部分肝切除术后，残余肝叶体积增大，大部分肝脏质量于7~8 d内恢复［7］。这得益于肝脏细胞外基质独特的形态学结构和各种生长因子等多因素共同作用［8］，同时，肝脏产生的EV对肝脏组织的再生也有积极作用［9］。更重要的是，我国作为畜牧业大国具备较大的动物存量，国家统计局公布2023年生猪出栏量为72 662万头，以猪肝质量占体质量1.5%~3.0%计算［10］，每年产出的猪肝质量为86.91~173.82万吨，可有效补足EV产量低的问题。肝脏与骨组织间有大量的信息交流，肝-骨轴的作用一直受到较多学者关注［11］。受到肝脏强大再生功能的启发，本项研究通过提取、鉴定和表征肝组织EV（liver tissue-derived EV，LT-EV），并对输注LT-EV的下颌骨缺损小鼠进行体内LT-EV生物学分布以及促颌骨缺损再生修复的有效性和安全性进行研究，以期为临床颌骨缺损治疗提供一种可行的治疗方式。
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（参考文献略）