【论著】衰老清除药物对规模化长期培养牙髓干细胞增殖和分化功能的影响
点击“中华口腔医学杂志”可快速关注本刊官微
作者：王冠玉 廖立 田卫东
通信作者：田卫东
作者单位：四川大学华西口腔医院创伤整形外科 口腔疾病防治全国重点实验室 国家口腔医学中心 国家口腔疾病临床医学研究中心 教育部口腔转化医学工程研究中心
引用本文：王冠玉, 廖立, 田卫东. 衰老清除药物对规模化长期培养牙髓干细胞增殖和分化功能的影响[J]. 中华口腔医学杂志, 2024, 59(5): 444-452. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20240119-00030.
目的
探讨间断清除衰老细胞对规模化长期培养中牙髓干细胞（DPSC）增殖和分化功能的影响，探索维持体外培养DPSC年轻状态的方法。
方法
从四川大学华西口腔医院口腔颌面外科提供的因正畸或阻生拔除的健康恒牙中提取人DPSC，模拟DPSC体外规模化长期培养过程，并对年轻DPSC（第5代，P5）、衰老DPSC（第25代，P25）进行细胞衰老β-半乳糖苷酶染色、集落形成实验、成骨分化诱导茜素染色实验。利用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色比较5种衰老清除药物［那维克拉（ABT-263）、姜黄素、达沙替尼、非瑟酮、槲皮素］的清除效率，选择清除效率最高的药物进行后续实验。选取衰老细胞占比开始显著增多的代数，给予间隔3代、累计3次的衰老清除药物处理，对对照组和药物处理组细胞进行荧光细胞衰老β-半乳糖苷酶染色、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、集落形成实验、细胞划痕实验、成骨诱导茜素红染色实验。体内验证使用裸鼠皮下异位成骨实验，对移植物进行HE染色、免疫组织化学染色。
结果
衰老细胞占比随培养周期延长而增加，相比年轻DPSC，衰老DPSC的增殖和成骨分化能力显著减退（P<0.05）。与年轻DPSC相比，衰老DPSC衰老相关蛋白p21、p16INK4a、白细胞介素6（IL-6）mRNA及增殖相关蛋白Ki67 mRNA表达量均发生显著改变（P<0.001）。5种衰老清除药物中，ABT-263衰老细胞占比最少。培养过程中间断使用ABT-263后，药物处理组衰老细胞占比［（6.72±2.34）%］显著小于对照组［（31.82±0.57）%］（P<0.001）；RT-qPCR证实，药物处理组p21、p16INK4a、IL-6 mRNA表达量均显著小于对照组（P<0.05），Ki67 mRNA表达量显著大于对照组（P<0.01）。药物处理组的细胞愈合能力、成骨分化能力均显著大于对照组（P<0.05）。体内实验结果显示，药物处理组DPSC的移植体内后相对新生骨质面积［（2.36±0.48）%］显著大于对照组［（1.00±0.46）%］（P<0.05）。
结论
ABT-263可有效清除规模化长期培养DPSC的衰老细胞，培养过程中不断给予的ABT-263处理可维持规模化长期培养DPSC的体内及体外增殖、分化功能。
起源于神经嵴的牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）因样本来源广泛、自我更新及分化能力强、免疫原性低等特点，成为再生医学研究理想的细胞来源［1］。除用于口腔组织再生如牙周再生、牙髓再生外［2, 3, 4］，DPSC在阿尔茨海默病、糖尿病等疾病的临床治疗中也有较好的应用前景［5, 6, 7］。近年，涉及DPSC的临床研究正在逐步开展［8, 9］，将该类细胞正式用于临床，充足的细胞数量是基础，体外传代扩增是唯一的制备方法。然而，体外规模化长期培养可使DPSC经历细胞衰老［10, 11］，伴随干细胞表型丢失、自我更新停滞以及分化能力受限［12, 13］。同时细胞衰老过程中产生的衰老相关分泌表型（senescence associate secretory phenotype，SASP），如肿瘤坏死因子α、白细胞介素（interleukin，IL）-6、基质金属蛋白酶等可调控细胞通路对周围细胞及微环境产生的影响，引起炎症反应，使干细胞疗效不符合预期，带来伦理、安全难题［14, 15］。
针对细胞衰老这一问题，学者对系列衰老清除药物开展了全面、深入的研究［16］。利用衰老细胞抗凋亡、β-半乳糖甘酶活性增加以及高表达特异性膜蛋白的特点，衰老清除药物可识别并特异性杀死衰老细胞［17, 18］。大量研究显示，使用衰老清除药物移除体内外衰老细胞后，衰老小鼠心功能、造血系统功能得到提高，甚至寿命得以延长［16，19, 20, 21］。本项研究探讨使用衰老清除药物间断性清除规模化长期培养过程中衰老细胞对DPSC增殖和分化功能的影响，以探索维持体外培养DPSC年轻状态的方法。
请点击“阅读原文”获取全文
（参考文献略）