【论著】原花青素通过转录因子EB诱导的自噬-溶酶体途径促进人牙周膜干细胞成骨分化的研究
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作者:刘卓 李麒麟 巫雅欣 汪向垚 毛靖 龚士强
通信作者:龚士强
作者单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心口腔正畸科 华中科技大学同济医学院口腔医学院 口腔颌面发育与再生湖北省重点实验室
引用本文:刘卓, 李麒麟, 巫雅欣, 等. 原花青素通过转录因子EB诱导的自噬-溶酶体途径促进人牙周膜干细胞成骨分化的研究[J]. 中华口腔医学杂志, 2024, 59(5): 453-462. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20240311-00108.
目的
研究原花青素(PA)调节人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的具体机制,探讨PA对转录因子EB(TFEB)的表达和自噬-溶酶体途径的影响。
方法
将PDLSCs分为对照组和PA组,通过转录组测序(RNA Seq)分析差异表达基因,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、碱性磷酸酶(ALP)染色和透射电子显微镜(TEM)观察细胞成骨能力和自噬水平。通过划痕实验和Trasnwell实验检测PDLSCs的迁移能力,溶酶体荧光探针(Lysotracker)染色和免疫荧光染色检测溶酶体的生物发生,蛋白质印迹法检测TFEB总蛋白及其在细胞质和细胞核中的表达,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察TFEB的核易位。使用小干扰RNA(siRNA)技术敲低TFEB基因,进行PA处理或无处理。蛋白质印迹法检测细胞中自噬标志物苄氯素1(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)和成骨标志物Runt相关转录因子2(RUNX2)、ALP和骨钙素的表达。
结果
与对照组相比,PA组中PDLSCs的成骨和自噬相关基因出现差异性表达(P<0.05)。PA组中成骨相关基因RUNX2(2.32±0.15)、Ⅰ型胶原蛋白ɑ1链(COL1α1)(1.80±0.18)和自噬相关基因LC3B(1.87±0.08)、Beclin1(1.63±0.08)的mRNA表达水平均显著高于对照组(分别为1.01±0.16、1.00±0.10、1.00±0.07、1.00±0.06)(均P<0.01)。与对照组相比,PA组的ALP活性更高,TEM镜下自噬体和自噬溶酶体数目更多。PA显著促进了PDLSCs的迁移(P<0.05),并增加了溶酶体的数量和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的表达。PA组中TFEB总蛋白的相对表达水平(1.49±0.07)和TFEB在细胞核/细胞质中的相对表达水平(1.52±0.12)均显著高于对照组(分别为1.00±0.11、1.00±0.13)(均P<0.01)。PA组TFEB的细胞核/细胞质相对荧光强度(0.79±0.09)也显著高于对照组(0.11±0.08)(t=8.32,P<0.01)。敲低TFEB后,PDLSCs中TFEB(0.64±0.04)、LAMP1(0.69±0.09)、Beclin1(0.60±0.05)和LC3B Ⅱ/Ⅰ(0.73±0.07)蛋白的表达均显著低于阴性对照组(分别为1.00±0.15、1.00±0.10、1.00±0.05、1.00±0.06)(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。敲低TFEB后PA组中Beclin1(1.05±0.11)、LC3B Ⅱ/Ⅰ(1.02±0.09)、RUNX2(1.04±0.10)、ALP(1.04±0.16)和骨钙素(1.03±0.15)的表达均显著低于敲低前(分别为1.28±0.03、1.44±0.11、1.38±0.11、1.62±0.11、1.65±0.17)(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。
结论
PA通过促进PDLSCs中TFEB的表达和核易位,激活自噬-溶酶体途径,促进PDLSCs的成骨分化。
肿瘤、炎症和创伤等因素引起的牙槽骨丧失可导致牙齿脱落,造成口腔美观和功能的损害,给全球公共卫生事业的建设带来巨大挑战[1]。安全有效地实现牙槽骨再生一直是口腔再生领域的研究热点。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一种源自牙周韧带组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),占据牙周膜细胞群体的27%,能分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞、神经细胞、肌细胞等多种类型细胞[2, 3]。由于长期处于细菌和炎症并存的复杂牙周微环境中,PDLSCs相较于其他MSCs在增殖分化、血管生成、免疫调节和炎症抵抗方面具有优势[1,4]。通过对成骨祖细胞来源进行细胞谱系追踪,发现来自牙周韧带的间充质祖细胞是牙槽骨内成骨细胞的主要来源[5]。因此,PDLSCs被认为是实现牙槽骨、牙周膜、牙骨质再生以及重建牙周微环境的种子细胞。
在干细胞分化过程中,自噬通过降解、重塑和再利用预先存在的内容物作为细胞合成的主要底物来源[6]。自噬是一种进化上保守的分解代谢过程,包括吞噬体的形成、自噬体的成熟和自噬溶酶体的降解,溶酶体是该过程的中心枢纽[7]。转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)是自噬-溶酶体途径的核心调控因子[8],可以调控自噬和溶酶体相关基因的转录,控制溶酶体的生物发生[9]。
研究指出,原花青素(proanthocyanidin,PA)等多酚药物通过调节炎症、减轻氧化应激、调节骨代谢平衡等作用促进MSCs的成骨分化,减少牙周炎症性的骨丢失[10, 11]。近期研究发现,多酚能通过自噬提高骨髓MSCs、牙龈MSCs等干细胞的成骨分化能力[12, 13, 14]。因此,推测PA可能通过自噬-溶酶体途径促进PDLSCs的成骨分化。本实验拟检测PA处理后自噬和成骨相关蛋白的表达、溶酶体的生物发生以及自噬-溶酶体途径调控因子TFEB的表达,并通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)实验研究TFEB对PA诱导的PDLSCs自噬和成骨分化的影响,为PA在牙槽骨再生治疗中的应用提供参考。
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(参考文献略)