【论著】原花青素通过转录因子EB诱导的自噬-溶酶体途径促进人牙周膜干细胞成骨分化的研究
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作者：刘卓 李麒麟 巫雅欣 汪向垚 毛靖 龚士强
通信作者：龚士强
作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心口腔正畸科 华中科技大学同济医学院口腔医学院 口腔颌面发育与再生湖北省重点实验室
引用本文：刘卓, 李麒麟, 巫雅欣, 等. 原花青素通过转录因子EB诱导的自噬-溶酶体途径促进人牙周膜干细胞成骨分化的研究[J]. 中华口腔医学杂志, 2024, 59(5): 453-462. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20240311-00108.
目的
研究原花青素（PA）调节人牙周膜干细胞（PDLSCs）成骨分化的具体机制，探讨PA对转录因子EB（TFEB）的表达和自噬-溶酶体途径的影响。
方法
将PDLSCs分为对照组和PA组，通过转录组测序（RNA Seq）分析差异表达基因，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、碱性磷酸酶（ALP）染色和透射电子显微镜（TEM）观察细胞成骨能力和自噬水平。通过划痕实验和Trasnwell实验检测PDLSCs的迁移能力，溶酶体荧光探针（Lysotracker）染色和免疫荧光染色检测溶酶体的生物发生，蛋白质印迹法检测TFEB总蛋白及其在细胞质和细胞核中的表达，激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察TFEB的核易位。使用小干扰RNA（siRNA）技术敲低TFEB基因，进行PA处理或无处理。蛋白质印迹法检测细胞中自噬标志物苄氯素1（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）和成骨标志物Runt相关转录因子2（RUNX2）、ALP和骨钙素的表达。
结果
与对照组相比，PA组中PDLSCs的成骨和自噬相关基因出现差异性表达（P<0.05）。PA组中成骨相关基因RUNX2（2.32±0.15）、Ⅰ型胶原蛋白ɑ1链（COL1α1）（1.80±0.18）和自噬相关基因LC3B（1.87±0.08）、Beclin1（1.63±0.08）的mRNA表达水平均显著高于对照组（分别为1.01±0.16、1.00±0.10、1.00±0.07、1.00±0.06）（均P<0.01）。与对照组相比，PA组的ALP活性更高，TEM镜下自噬体和自噬溶酶体数目更多。PA显著促进了PDLSCs的迁移（P<0.05），并增加了溶酶体的数量和溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的表达。PA组中TFEB总蛋白的相对表达水平（1.49±0.07）和TFEB在细胞核/细胞质中的相对表达水平（1.52±0.12）均显著高于对照组（分别为1.00±0.11、1.00±0.13）（均P<0.01）。PA组TFEB的细胞核/细胞质相对荧光强度（0.79±0.09）也显著高于对照组（0.11±0.08）（t=8.32，P<0.01）。敲低TFEB后，PDLSCs中TFEB（0.64±0.04）、LAMP1（0.69±0.09）、Beclin1（0.60±0.05）和LC3B Ⅱ/Ⅰ（0.73±0.07）蛋白的表达均显著低于阴性对照组（分别为1.00±0.15、1.00±0.10、1.00±0.05、1.00±0.06）（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01）。敲低TFEB后PA组中Beclin1（1.05±0.11）、LC3B Ⅱ/Ⅰ（1.02±0.09）、RUNX2（1.04±0.10）、ALP（1.04±0.16）和骨钙素（1.03±0.15）的表达均显著低于敲低前（分别为1.28±0.03、1.44±0.11、1.38±0.11、1.62±0.11、1.65±0.17）（P<0.05，P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.01）。
结论
PA通过促进PDLSCs中TFEB的表达和核易位，激活自噬-溶酶体途径，促进PDLSCs的成骨分化。
肿瘤、炎症和创伤等因素引起的牙槽骨丧失可导致牙齿脱落，造成口腔美观和功能的损害，给全球公共卫生事业的建设带来巨大挑战［1］。安全有效地实现牙槽骨再生一直是口腔再生领域的研究热点。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是一种源自牙周韧带组织的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），占据牙周膜细胞群体的27%，能分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞、神经细胞、肌细胞等多种类型细胞［2, 3］。由于长期处于细菌和炎症并存的复杂牙周微环境中，PDLSCs相较于其他MSCs在增殖分化、血管生成、免疫调节和炎症抵抗方面具有优势［1，4］。通过对成骨祖细胞来源进行细胞谱系追踪，发现来自牙周韧带的间充质祖细胞是牙槽骨内成骨细胞的主要来源［5］。因此，PDLSCs被认为是实现牙槽骨、牙周膜、牙骨质再生以及重建牙周微环境的种子细胞。
在干细胞分化过程中，自噬通过降解、重塑和再利用预先存在的内容物作为细胞合成的主要底物来源［6］。自噬是一种进化上保守的分解代谢过程，包括吞噬体的形成、自噬体的成熟和自噬溶酶体的降解，溶酶体是该过程的中心枢纽［7］。转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）是自噬-溶酶体途径的核心调控因子［8］，可以调控自噬和溶酶体相关基因的转录，控制溶酶体的生物发生［9］。
研究指出，原花青素（proanthocyanidin，PA）等多酚药物通过调节炎症、减轻氧化应激、调节骨代谢平衡等作用促进MSCs的成骨分化，减少牙周炎症性的骨丢失［10, 11］。近期研究发现，多酚能通过自噬提高骨髓MSCs、牙龈MSCs等干细胞的成骨分化能力［12, 13, 14］。因此，推测PA可能通过自噬-溶酶体途径促进PDLSCs的成骨分化。本实验拟检测PA处理后自噬和成骨相关蛋白的表达、溶酶体的生物发生以及自噬-溶酶体途径调控因子TFEB的表达，并通过小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）实验研究TFEB对PA诱导的PDLSCs自噬和成骨分化的影响，为PA在牙槽骨再生治疗中的应用提供参考。
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（参考文献略）